[個人寫作]生活飲品的簡易蛋白質測定與蛋白質基礎特性－小蟑螂的土土小窩

圖片：運用優碘稀釋液和酒精以及部分測定電極就可帶領中小學生操作簡易的澱粉分析和蛋白質分析。

作者：嚴融怡

日常生活當中，要怎樣才可以運用簡單的方法知道一些飲品當中的蛋白質含量，首先我們必須從蛋白質的特性去著手。首先大部分的蛋白質鍵結其實不耐高熱，因此加熱法其實是最快速簡便的方法。網路上有一套簡易約略知道豆漿蛋白質含量的方法，首先將豆漿倒進碗內隔水加熱，當表層出現薄膜或紋路時，隨即關火，並且開始計時80秒內哪一樣品會出現較完整的豆皮，一般如果在80秒內表面出現完整結皮，表示豆漿樣品的蛋白質含量較多，如果結皮破碎或沒有出現結皮，則代表該家的豆漿蛋白質含量較少。這個方法也可以做一些改變運用在牛奶乳蛋白的測定方面，牛奶加溫到攝氏40度以上，乳蛋白遇熱凝固也會在表面形成一層薄膜，當溫度逐漸增高或時間拉長，使得薄膜的厚度增加，也可作為乳蛋白含量的依據(也可以取出比對不同的薄膜，加以量測它們的重量，用以粗略定量比較不同製品的蛋白質含量)。

每一種蛋白質都具備其本身的特性以及其三度空間結構，當蛋白質失去原有的三度空間結構(立體構造)，便會產生變性，這個變性的過程可能是可逆的，也可能是不可逆的。像是熱所造成的雞蛋白蛋白的凝固便是不可逆的過程。這在烹煮食物上也常常見於肉類食品，也使加熱食物中的蛋白質在消化道當中更容易消化(受蛋白質水解酶的作用)。有些化學藥劑可以使蛋白質發生可逆變性，像是尿素和硫氫基乙醇(mercaptoethanol)；尿素可以破壞蛋白質當中的水結構(water structure)，減少胺基酸(蛋白質的基本組成)側鏈R-基團的疏水性作用，最終導致蛋白質分子的氫鍵破壞，並且產生不摺疊與構型破壞；硫氫基乙醇可以減少S-S鍵結。因此當環境中去除尿素和硫氫基乙醇添加的條件，是有可能重新讓受影響蛋白質恢復原狀的。蛋白質受高溫影響的變性多為不可逆的，而由於蛋白質參與生物細胞的結構組成或是特定功能的酵素，因此生物為預防特定蛋白質變性也會有保護的措施，熱休克蛋白(Heat shock proteins)就是其中一種常見於細胞應對熱脅迫的功能性蛋白質，它可協助蛋白質正常摺疊或是調節細胞膜的形變等等。

蛋白質的摺疊包括蛋白質內部大量的弱分子作用力(包括疏水性、靜電與凡德瓦力等等)以及蛋白質和溶液之間的平衡情形。因此如果蛋白質所處的環境條件包括溫度、鹽度、壓力、高無機鹽濃度、重金屬、強酸和強鹼、醇類等作用都有可能產生蛋白質變性。蛋白質的溶解度，受溶液中酸鹼度與離子濃度的影響很大。當溶液中的酸鹼度逐漸接近某一蛋白質的等電點時，此蛋白質的溶解度會逐漸下降，這是因為蛋白質分子上的淨電荷漸趨於零，使得蛋白質分子之間的互斥力降低。此外，這個淨電荷為零的蛋白質分子上，事實上還是有數目相同的正負電荷，這些正負電荷對互相吸引也有貢獻。可以利用這種特性，來沈澱出某已知等電點的蛋白質。鹽類的添加則對於蛋白質有時會造成溶解度提高的情形，這就是鹽溶(Salting-in)，有時則會造成蛋白質的沉澱量提高，這則是鹽析(Salting-out)，此二者通常所用的鹽類並不相同，造成的作用機制不同，彼此也沒有關係。鹽析所造成的蛋白質沉澱由於空間結構沒有發生根本的改變，因此也是屬於可逆的變性。

圖片：將少許木瓜牛奶倒入飽和食鹽溶液當中所發生的鹽析沉澱現象。

高濃度乙醇在一定時間的作用下可以造成蛋白質的變性，低濃度的乙醇則可讓蛋白質的氫鍵受破壞進而發生類似鹽析的沉澱。這兩類都是可以造成蛋白質的沉澱。因此如果是要有濃度數值的測定，可以運用市面上用來測量水中總溶解固體量(Total dissolved solids, TDS)的簡易型數位TDS水質檢測筆作為測定的儀器。以牛奶和豆漿來說，由於數位TDS水質檢測筆的測量數值有限，因此可以將原液搖晃均勻後，取10ml的待測牛奶(或待測豆漿)，然後以純水稀釋10倍，然後測量其ppm數值。之後再倒入特定體積的95%酒精(可以取10ml或25ml不等)加入到溶液當中搖晃均勻，然後靜置1分鐘待其沉澱反應進行，再測定沉澱反應後的TDS數值。然後將稀釋倍率重新乘回去。將反應前的總溶解固體量減掉反應後的總溶解固體量，即可獲得被乙醇反應發生沉澱的蛋白質含量。雖然酸、鹼、鹽等其他因素也可以讓蛋白質發生變性沉澱，但因為數位TDS水質檢測筆主要是以電導度法來測定溶質的，而其他這些方法均可能增加溶液當中的其他極性離子，並且干擾數據，而乙醇則屬於數位TDS水質檢測筆所監測不到的溶質，因此以乙醇來作為反應物。這個方法也同樣可以提供粗略的數據顯示飲品中的蛋白質含量。

在環境化學、食品化學與生物化學真正比較標準的蛋白質測定方式包括凱氏定氮法(Kjeldahl method)、紫外光吸收法(UV法)、雙縮脲法、考馬斯亮藍法(bradford)、Lowry法、BCA法、Dumas法等等。這裡簡述凱氏定氮法、雙縮脲法和考馬斯亮藍法。其中凱氏定氮法是丹麥化學家凱耶達爾(Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl)在1883年所發明的，這套方法雖然最初是設計用來測定啤酒工業穀物當中的蛋白質含量，但其實整套方法是以總氮的分析來回推蛋白質含量，全套分析大致包含三個步驟程序：(1)將樣品與濃硫酸(有時會搭配分解促進劑如硫酸鉀、硫酸銅與硒)共熱使其中的氮轉化為硫酸銨與硫酸氫銨的混合分解液。(2)在消化分解液加入氫氧化納調整pH值至10，這時會將銨離子轉化為氨。在蒸餾裝置當中以硼酸溶液加以吸收。(3)以標準溶液滴定計算氮量。透過凱氏定氮法測得的含氮量一般被稱作『總凱氮量』。總凱氮量有時並不能真正地反映樣本中的蛋白質含量，因為所測得的含氮量其實有不少並不是由蛋白質所轉化而來。凱氏定氮法還必須透過一些經驗公式的轉換因子來換算出蛋白質含量。像是大豆的轉換因子常為5.71、花生的轉換因子為5.46等等；因此這套方法的精準度有限，已無法合乎晚近生物化學和食品化學等需求。但在環境化學、農藝學與土壤化學所對於環境介質、土壤介質與植體總氮素等需要應對環境複雜因子的氮素分析則仍是非常好用的分析法，且現今已經有全自動的裝置可以快速進行(筆者十多年前學生時代曾操作過舊式手動的凱氏定氮法，從備料到分析需要花幾個小時的時間，但現今新式的自動機械則非常快)。

圖片：凱耶達爾1880年間在嘉士伯實驗室工作照，後方有當時測量凱氏氮的裝置(圖片引自維基共享資源)。

雙縮脲法是使用雙縮脲試劑(Biuret reagent)作為鑑定蛋白質的分析試驗法，雙縮脲試劑由1%氫氧化鉀(或是氫氧化鈉，這個溶液主要提供鹼性環境)、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。當測試物中含有多肽，試液中的銅會與多肽產生紫色的配位化合物。然後便可透過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑑定反應的靈敏度為5～160 mg/mL。雙縮脲法的靈敏度較差(10mg左右)，且會受到樣品中如硫酸銨、Ammonia及甘油(Glycerol)等物質的干擾，常會花較多的時間與其他方法排除干擾物。不過Biured方法準確度較高，且不受蛋白質種類所影響。Lowry法為Biuret法所改進的延伸方法，具有較佳的靈敏度(可測到0.1mg)，實驗過程也仍然會受硫酸銨、碳水化合物等物質的干擾。

考馬斯亮藍法(Coomassie Brilliant Blue；Bradford protein assay)是1964年由Fazekas de St.Groth團隊發展出來的，將十九世紀以來所發展出來的考馬斯系列染料之一考馬斯亮藍R-250運用在蛋白質的測定上，他們將蛋白質―染料相結合，定量測定微量蛋白質的濃度。這是目前最快速、靈敏的測定方法之一，比Lowry法的靈敏度又高出許多。而且反應迅速，只需五分鐘左右。因此在近幾年正被快速應用推廣。但它的缺點是在應對不同蛋白質的測定時容易有偏差。然後仍然會受到包括十二烷基硫酸鈉 (SDS)等物質的干擾。

在蛋白質的分析法當中，每一種方法或多或少都會受到其他物質的干擾。但是隨著新技術的推陳出新，未來應該會有更為精巧的分析方式不斷被研發出來。

參考引用資料：

1.李芳胤、陳士賢編著。2007。土壤分析實驗手冊。新文京開發出版股份有限公司。

2.Peter N. Campbell, Anthony D. Smith, Timothy J. Peters原著。蕭明熙、洪麗滿、吳宗舜、朱柏如翻譯。2008。圖解生物化學─後基因體世代的生物化學與分子生物學(Biochemistry ILLUSTRATED, Biochemistry and Molecular Biology in the Post-genomic Era, 5e)。台灣愛思唯爾有限公司發行。

3.豆漿、豆奶傻傻分不清？補充蛋白質應該這樣選！ -Heho健康

https://heho.com.tw/archives/39275

4.蛋白質定量法 ─輔仁大學高教深耕計畫網頁 http://www.excellence.fju.edu.tw/plan/2.1.1.c/content04/html/51.htm

5.凱氏定氮法 ─維基百科 https://zh.wikipedia.org/wiki/%E5%87%AF%E6%B0%8F%E5%AE%9A%E6%B0%AE%E6%B3%95

6.凱耶達爾 ─維基百科

https://zh.wikipedia.org/wiki/%E5%87%AF%E8%80%B6%E8%BE%BE%E5%B0%94

7.熱休克蛋白─維基百科

https://zh.wikipedia.org/wiki/%E7%83%AD%E4%BC%91%E5%85%8B%E8%9B%8B%E7%99%BD

8.酵素化學實驗─國立台灣大學莊榮輝教授網頁

http://juang.bst.ntu.edu.tw/Protein/Purification/P1.htm

9.關於牛奶兩三事：原來奶皮可以吃！ ─鮮乳坊部落格

http://ilovepuremilk.blogspot.com/2016/04/blog-post.html